微生物限度检查操作

微生物限度检查操作的若干问题
除微生物制剂外，药品微生物限度检查与药品中有效成分的含量测定显著不同，其检查对象具有以下特点：
1 活体易变性
菌细胞在药品中处于不稳定状态，可随存放时间延长死亡，也可在适宜条件下增殖。一批液体制剂若不含防腐剂，它可能是出厂时合格，贮存时不合格，zui终又可能“合格”。当保存条件稳定时，其污染量在一定时间内处于动态平衡，总体污染状况可以标准化的条件予以正确评估。
2 分布不匀
除产品在生产前期污染外，通常是局部的。一批产品中不同瓶（盒）中污染状态会出现差异，其污染量特别是致病菌通常是少量的。检验样品的代表性有赖于合理的抽样方法。
3 多数处于受损伤状态
药品中污染的微生物，受到原料处理、加工等过程的影响，或者药品本身对微生物的抑杀作用，使其受到一定程度的损伤，这些受伤的微生物用一般的方法检查，往往会出现假阴性或计数偏低的结果。
4 生态环境多样复杂
污染菌的来源多样，种类多样，加之药品种类繁多、剂型成分复杂，同一种菌在不同的药剂中所测得的结果各不相同。
微生物限度检查必须遵循以下原则：
1样品正式检验前必须保持原污染状态。防止第二次污染和防止污染微生物的繁殖或死亡。
2应有适当的供试液制备方法。供试液的正确制备是保证检验结果准确可靠的前提。
3检验方法准确可靠
4检验结果判断无误
作好微生物限度检验，检验人员的职业品德和业务素质至关重要。
建立科学的质量保证体系，是获取检验结果正确可靠的基本保证。

一、检验样品保持原污染状态
1 防止再污染无菌技术
设备和无菌操作（略）
2 防止再繁殖或死亡
21 样品应为未开启的原包装、检验前保存条件应与药品贮存条件相同。
22从样品接触稀释剂至接种（注皿）应在1小时内完成，对多批样品应分段接种（注皿）。
23抑菌性药品供试液制备，应尽可能缩短制备时间并注意污染微生物的减失（离心、温度）。

二、供试液制备

1稀释剂药典规定使用0.9%无菌氯化钠及无菌磷酸盐缓冲液，从保护菌细胞及有利菌细胞的恢复考虑，有必要研究改进。
2量具衡器电子称药物天平感量应小于0.1g
容器及吸管现无设备要求误差小于1％
吸管1ml分度值0.01ml，10ml分度值0.1ml
口径不大于2mm
3 称（吸）量固体、半固体10g
液体10ml
膜剂以面积计
分散方式匀浆仪3000～5000rpm，2－4min
4稀释固体加稀释剂100ml，液体加稀释剂90ml，与国外药典规定有差别。样品应充分均质或乳化分散在稀释剂中。对胶囊、胶剂等先打碎再溶解，对栓剂及油剂加适量分散剂，对油膏基质软膏加适宜乳化剂，如司盘、单硬脂酸甘油酯、吐温等。
抑菌性样品：
菌数测定，目前未规定处理方法
控制菌检查，水溶性样品：薄膜过滤、稀释、离心沉淀
混悬液：二次离心
乳浊液：离心法
灭活剂的使用需依品种分别测试
处理时间宜控制在zui短时间内
稀释方法：吸液在离液面25cm处，放液离第二管液面不高于1cm，管内混和吹打不少于10次，瓶内振荡混合不少于15s’。

三、方法和结果判断

目前我国微生物限度检查在方法标准化、灵敏度、科学性等方面与国外相比还存在一定差距，质量保证体系的建立尚须作许多工作，现就我国现行方法提出一些问题共同讨论。
1 菌数测定
我国采用平板稀释法
11 稀释度我国现规定稀释级至少为三级
三级稀释度的平均菌落生长数互为比照，能较为真实反映药品中的污染菌量，防止错误判断，对于抑菌性药品的菌数确定尤其重要。在10-1、10-2稀释级不生长或少生长而在10－3级平板生长的情况并不少见。
12阴性对照检查用具、稀释剂、培养基及检测环境的本底状态以确认样品检验的可靠性，是检验质量保证的重要步骤。
13培养基培养基的质量是菌数测定的关键因素。
培养基注皿量及培养温度对菌数测定有影响
14点计实际工作中注意细菌、酵母菌及霉菌的区别，细菌与药渣的区别，霉菌与药物结晶的区别。
菌落蔓延、重叠、连线生长情况的处理。
不能作为计数依据的几种情况：三级平板菌落数不能显示差别；当平板平均菌数＞15时，二个平板菌落数相差1倍以上；平板平均菌落数≤15时二个平板的菌落数不在0-4''1-7''2-9''3-10''4-12''5-14''6-15范围内。
15报数报数规则的有关问题
细菌数测定报数的举例：
①、一个稀释级平均菌落数在30－300时：
10-110-210-3处理原则报告数
13281取10－1320
26448取10－24400
322056继续稀释
②、二个稀释级平均菌落数在30－300时：
10-110-210-3处理原则报告数
1280428比值≤2''取10－210－2平均值3500
230013034比值2''取10－21300
③、三个稀释级平均菌落数均不在30－300时：
10-110-210-3处理原则报告数
128012037取10－212000
229022040取10－210-3平均值31000
④、各稀释级平均菌落数均不在30－300时
10-110-210-3处理原则报告数
1多不可计1560342取10－3340000
2310248取10－22400
328124取10-1280
412121
培养基稀释法
5121
⑤、菌数报告不合理的举例
10-110-210-3处理原则报告数
1302802010－2／10-1取10－2300
2422908010－3／10-2取10－229000
3322404210－3／10-2取平均值33000
16 复试复试是对菌数结果在合格边缘的一种处理办法。
17日常工作中几种情况的处理：液体制剂发生爆破（或塑瓶膨胀）而常规检查方法“合格”；相似菌落在二种平板上同时生长；对生长菌落数明显不符合稀释分布规律者。
2控制菌检查
药品中污染的控制菌数量少、分布不匀，且多受药物影响呈亚致死状态，适宜的增菌培养方法和高灵敏度的培养基是提高阳性检出率的关键。
为了保证试验方法的可靠性，药典规定的阳性对照与阴性对照试验是必须的。阳性对照菌须加入供试液中与供试品检验同时进行平行试验。在试验中，当已知阳性菌不能检出时，该项控制检验结果无效，须认真研究原因，重点考虑药品的抑菌作用并制定灭活处理方法。
目前药典规定的阳性对照菌种，多为具有毒力的致病菌如乙型副伤寒沙门氏菌，破伤风梭菌等，为防止试验中污染供试品检验环境，作阳性菌对照试验时应与供试品检验分开进行，使用操作间或接种台。
（1）大肠杆菌检查（略）
（2）沙门氏菌检查
① 增菌培养预增菌营养肉汤
增菌四硫磺酸盐煌绿肉汤
沙门菌在增菌培养液中呈均匀混浊、无菌膜、无沉淀。
② 分离培养DHL''SS;EMB''MacC
疑似菌落为透明或半透明，无色（或微显培养基色）
在含H2S指示系统培养基上菌落中心呈黑色
发酵乳糖的亚属Ⅲ其菌落呈乳糖指示系统颜色
③ 初步鉴别疑似培养物在TSI上为K/AH2S＋，K/AH2S－，A/AH2S＋
④生化反应
H2S赖氨酸脱羧酶靛基质脲酶
沙门菌属反应＋＋--－
＋＋＋少见--
－＋--－
⑤血清凝集试验直接凝集试验＋
或煮沸30分钟后凝集试验＋
⑥结果判断革兰氏阴性杆菌④及⑤两项均符合报告检出沙门菌
当④及⑤两项中一项不符合时进一步检验
当④及⑤两项均不符合时报告未检出沙门菌
（3）金黄色葡萄球菌检查
① 增菌培养营养肉汤、亚碲酸钠肉汤，均匀混浊，稍有沉淀
② 分离培养卵黄氯化钠平板，甘露醇氯化钠平板，血平板
疑似菌落金黄色、圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，有乳浊圈（卵黄氯化钠平板），黄色环（甘露醇氯化钠平板）、透明溶血环（血平板）
③ 生化试验及染色血浆凝固酶试验阳性
G＋球菌
④ 结果血浆凝固酶试验阳性，G＋球菌，报告阳性检验结果
（4）铜绿假单胞菌
增菌培养胆盐乳糖培养基液体表层生长旺盛、有菌膜
分离培养溴代十六烷*胺平板
疑似菌落灰白色扁平、圆或无定形，边缘不齐，周边呈扩散现象，典型者菌落周围呈蓝绿色。
生化试验及染色G－杆菌
①氧化酶试验＋
②绿脓菌素试验＋
③硝酸盐还原产气试验＋
④明胶液化试验＋
⑤41℃生长试验＋
结果G－杆菌①及②阳性作出阳性结果报告
G－杆菌①阳性②阴性
则③、④、⑤皆为阳性作出阳性结果报告
（5）破伤风梭菌检查
为厌氧梭菌，须以厌氧培养法检查
厌氧培养方法冷触媒法
焦性没食子酸法
增菌产毒培养产气、臭味、肉渣消化
染色镜检典型者为鼓槌样芽孢杆菌
毒力试验当增菌产毒培养出现疑似培养物时须作毒力试验，当染色镜检发现疑似破伤风梭菌者，*次毒力试验阴性时应连续进行二次增菌产毒培养，并接种新霉素血平板，刮取疑似菌作增菌产毒培养。
结果毒力试验阳性，不论镜检是否发现疑似破伤风梭菌，均作出阳性检验报告

平板细菌菌落计数置信区间

菌落总数 平均值 标准差 95％置信区间 99置信区间 范围
   下限   上限  下限  上限 
1 05000 05000 0013 1844 0003 2639 
2 10000 07071 0121 2786 0052 3715 
3 15000 08660 0309 3612 0169 4637 0-4
4 20000 10000 0545 4384 0336 5489 
5 25000 11180 0812 5127 0539 6297 
6 30000 12247 1101 5834 0768 7075 
7 35000 13229 1407 6530 1019 7830 1-7
8 40000 14142 1727 7211 1286 8567 
9 45000 15000 2058 7882 1566 9289 
10 50000 15811 2398 8542 1858 9999 2-9
11 55000 16583 2746 9195 2161 10699 
12 60000 17321 3100 9841 2472 11390 
13 65000 18028 3461 10481 2790 12072 3-10
14 70000 18708 3827 11115 3115 12748 
15 75000 19365 4198 11745 3447 13410 4-12
16 80000 20000 4573 12370 3783 14082 
17 85000 20616 4952 12992 4125 14741 
18 90000 21213 5334 13609 4472 15395 5-14
19 95000 21794 5720 14224 4822 16045 
20 100000 22361 6108 14835 5177 16691 6-15
21 105000 22913 6500 15444 5535 17334 
22 110000 23452 6894 16050 5896 17973 
23 115000 23970 7290 16654 6260 18609 7-17
24 120000 24495 7689 17256 6628 19242 
25 125000 25000 8089 17855 6998 19873 8-18
26 130000 25495 8492 18452 7370 20509 
27 135000 25981 8897 19040 7745 21125 9-19
28 140000 26458 9303 19642 78123 21740 
29 145000 26926 9711 20234 8052 22369 10-20
30 150000 27386 10120 20824 8884 22983