组织培养-无菌室操作规程

1. 无菌室室内温度保持在20-24℃，湿度保持在45-60%；室内应保持清洁，严禁堆放杂物，以防污染；
2. 无菌室应备有工作浓度的消毒液，如75%的酒精，0.1%的新洁尔灭溶液，优氯净，碘伏等等；无菌室应定期用适宜的消毒液灭菌清洁，以保证无菌室的洁净度符合要求；
3. 需要带入无菌室使用的器械，玻璃器皿等一切物品，均应包扎严密，并应经过适宜的方法灭菌（一般采用高温高压灭菌，1.2个大气压，121-126℃，30分钟）；
4. 工作人员进入无菌室前，必须修剪指甲，用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用75%的乙醇再次擦拭双手)，方可进入无菌室进行操作；
手的清洁流程：
（1）取下手上的饰物及手表，调节合适的水流，浸湿双手；
（2）取肥皂或适量肥皂液液涂抹双手；
（3）按“六部洗手法”顺序搓洗双手：
①掌心对掌心，两手并拢相互搓擦；
②手心对手背，手指交错相互搓擦（交换）；
③掌心相对，手指交叉沿指缝相互搓擦；
④用一只手握住另一只手拇指旋转搓擦（交换）；
⑤弯曲一手手指各关节，在另一只手掌心旋转搓擦（交换）；
⑥指尖在掌心转动搓擦（交换）；
（4）浸湿手的前臂部分（手腕至手肘），取肥皂或适量肥皂液液涂抹前臂，用手掌认真搓擦（交换）；
（5）流水冲洗，腕部略高于肘部，使污水从指尖流至手腕，防止水流入衣袖。
5. 无菌室使用前须用75%的乙醇擦拭超净工作台台面及四周，必须打开无菌室的紫外灯灭菌30分钟以上，同步开启臭氧消毒机，辅助进行臭氧消毒，同时打开超净工作台紫外灯并开启风扇按钮进行吹风。紫外灭菌结束后，关闭紫外灯及臭氧消毒机30分钟后才能进入无菌室进行操作；
6. 进入超净工作台开始工作前，必须先开启风扇及工作灯，点燃酒精灯，用75%的乙醇认真擦拭双手，之后才能进行工作；
7. 操作结束后，应及时清理无菌室，进行清扫：
①将使用过的操作工具及废液缸从超净工作台上取出；
②先用碘伏消毒液擦拭超净工作台台面及四周，再用75%的乙醇擦拭一遍，使其恢复成使用前状态；
③使用新吉尔灭液或碘伏消毒液进行地板擦拭等清洁工作，再用紫外灯辐照灭菌20分钟。
④在缓冲间脱下工作服，帽子，口罩，放回原位，离开缓冲间换下鞋子，结束工作。
8. 供试品(培养基、母苗)及包扎好的其他物品在开启前，应保持外包装完整，不得在超净工作台以外环境开启，以防污染。开启前，用75％的酒精棉球或消毒纱布认真擦拭外表面；
9. *次进行无菌操作前，应做阴性空白对照，以检查无菌操作、高压灭菌、培养室的可靠性；后期陆续操作过程中，若出现大面积污染，则下一批次操作应做阴性空白对照，以便查明污染原因；
10. 工作人员必须在每瓶分苗完毕的培养基瓶外做好标记，标记为“工作台号+培养基批次”，如工作台号为01，培养基批次为01，则标记为“0101” ；
11. 工作过程中出现饮水、上厕所等情况暂时离开无菌室后，工作服等应脱下并放置于隔离室衣帽架上，不得穿戴离开隔离室；再次进入前须重复规程“4” 中的步骤；